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熒光染料（簡(jiǎn)介，原理）
Release Time：2022-02-05熒光染料或熒光染料使用的研究人員能夠通過(guò)熒光顯微鏡觀察特定的生物分子，通常熒光染料與靶分子（例如抗體）結(jié)合，熒光染料用于免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。
熒光染料的介紹：
熒光染料，也稱為活性染料或熒光團(tuán)，已被生物學(xué)家使用了數(shù)十年。 與熒光蛋白相比，熒光染料提供更高的光穩(wěn)定性和亮度，并且不需要成熟時(shí)間。 然而，熒光染料通常通過(guò)抗體偶聯(lián)物或肽標(biāo)簽靶向感興趣的蛋白質(zhì)。 這需要固定細(xì)胞，這使得遺傳電路動(dòng)力學(xué)的測(cè)量變得不可能。 幾種熒光染料可用于活細(xì)胞，但在許多情況下，它們的適用性仍然有限。
熒光染料的原理：
熒光染料 的一個(gè)基本原理是在熒光劑的幫助下對(duì)細(xì)胞成分進(jìn)行高度特異性的可視化。這可以是一種熒光蛋白——例如 GFP——在基因上與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。如果克隆是不可能的——例如在組織學(xué)樣本中——使用免疫熒光染色等技術(shù)來(lái)可視化感興趣的蛋白質(zhì)。為此，使用與不同熒光染料連接并直接或間接與適當(dāng)目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡不僅限于蛋白質(zhì)，還可用于檢測(cè)核酸、聚糖和其他結(jié)構(gòu)。您甚至可以使用特定應(yīng)用的各種活細(xì)胞染料，這些染料允許使用細(xì)胞器選擇性染色（例如 ER、線粒體、高爾基體）或功能測(cè)定（例如，例如活細(xì)胞追蹤、標(biāo)記、細(xì)胞增殖或活死細(xì)胞測(cè)定，其中熒光是讀出方式。甚至可以檢測(cè)到鈣離子等非生物物質(zhì)。本文介紹了常用的熒光劑。
在熒光顯示過(guò)程中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質(zhì)。要么借助內(nèi)在熒光信號(hào)——通過(guò)將熒光蛋白與靶蛋白進(jìn)行基因連接——要么借助與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。對(duì)于一些生物學(xué)問(wèn)題，執(zhí)行后一個(gè)問(wèn)題更有用甚至是必要的。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ颖緛?lái)自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)快得多，在熒光蛋白技術(shù)中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉(zhuǎn)染到足夠的細(xì)胞中。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)在于它們本身就是蛋白質(zhì)的性質(zhì)。有了它，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)特征，這可能導(dǎo)致功能障礙或?qū)λ街母信d趣蛋白質(zhì)的誤解。然而，應(yīng)該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細(xì)胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對(duì)其抗原的非常特異性的結(jié)合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡(jiǎn)單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數(shù)情況下，使用兩種形式的抗體。第一個(gè)與目標(biāo)蛋白結(jié)合，本身沒(méi)有熒光標(biāo)記（一抗）。但是與一抗結(jié)合的第二種抗體（二抗）特異性地?cái)y帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一方面存在放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢挂环N二抗與一種一抗結(jié)合。另一方面，通常比用普通熒光染料標(biāo)記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
DNA染色
您可能想使用熒光染料研究核酸。例如，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞核來(lái)定義細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。最常見(jiàn)的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強(qiáng)度會(huì)增加。它被最大波長(zhǎng)為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對(duì)于 RNA 結(jié)合，也可以檢測(cè)到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質(zhì)膜，使其對(duì)固定細(xì)胞和活細(xì)胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項(xiàng)是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢(shì)的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結(jié)合條件下移動(dòng)到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)物中的活細(xì)胞和死細(xì)胞，因?yàn)樗荒苓M(jìn)入完整細(xì)胞。碘化丙啶 也是一種嵌入劑，但對(duì)不同的堿基沒(méi)有結(jié)合偏好。在核酸結(jié)合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為 538 nm。最高發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動(dòng)到較低的波長(zhǎng)和較低的強(qiáng)度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結(jié)合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無(wú)需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產(chǎn)生差異的染料是 吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對(duì)在 DNA 結(jié)合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進(jìn)入酸性區(qū)室，如陽(yáng)離子染料質(zhì)子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙 被藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強(qiáng)。它通常用于識(shí)別凋亡細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冇泻芏啾煌淌傻乃嵝愿糸g
熒光染料的介紹：
熒光染料，也稱為活性染料或熒光團(tuán)，已被生物學(xué)家使用了數(shù)十年。 與熒光蛋白相比，熒光染料提供更高的光穩(wěn)定性和亮度，并且不需要成熟時(shí)間。 然而，熒光染料通常通過(guò)抗體偶聯(lián)物或肽標(biāo)簽靶向感興趣的蛋白質(zhì)。 這需要固定細(xì)胞，這使得遺傳電路動(dòng)力學(xué)的測(cè)量變得不可能。 幾種熒光染料可用于活細(xì)胞，但在許多情況下，它們的適用性仍然有限。
熒光染料的原理：
熒光染料 的一個(gè)基本原理是在熒光劑的幫助下對(duì)細(xì)胞成分進(jìn)行高度特異性的可視化。這可以是一種熒光蛋白——例如 GFP——在基因上與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。如果克隆是不可能的——例如在組織學(xué)樣本中——使用免疫熒光染色等技術(shù)來(lái)可視化感興趣的蛋白質(zhì)。為此，使用與不同熒光染料連接并直接或間接與適當(dāng)目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡不僅限于蛋白質(zhì)，還可用于檢測(cè)核酸、聚糖和其他結(jié)構(gòu)。您甚至可以使用特定應(yīng)用的各種活細(xì)胞染料，這些染料允許使用細(xì)胞器選擇性染色（例如 ER、線粒體、高爾基體）或功能測(cè)定（例如，例如活細(xì)胞追蹤、標(biāo)記、細(xì)胞增殖或活死細(xì)胞測(cè)定，其中熒光是讀出方式。甚至可以檢測(cè)到鈣離子等非生物物質(zhì)。本文介紹了常用的熒光劑。
在熒光顯示過(guò)程中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質(zhì)。要么借助內(nèi)在熒光信號(hào)——通過(guò)將熒光蛋白與靶蛋白進(jìn)行基因連接——要么借助與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。對(duì)于一些生物學(xué)問(wèn)題，執(zhí)行后一個(gè)問(wèn)題更有用甚至是必要的。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ颖緛?lái)自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)快得多，在熒光蛋白技術(shù)中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉(zhuǎn)染到足夠的細(xì)胞中。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)在于它們本身就是蛋白質(zhì)的性質(zhì)。有了它，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)特征，這可能導(dǎo)致功能障礙或?qū)λ街母信d趣蛋白質(zhì)的誤解。然而，應(yīng)該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細(xì)胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對(duì)其抗原的非常特異性的結(jié)合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡(jiǎn)單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數(shù)情況下，使用兩種形式的抗體。第一個(gè)與目標(biāo)蛋白結(jié)合，本身沒(méi)有熒光標(biāo)記（一抗）。但是與一抗結(jié)合的第二種抗體（二抗）特異性地?cái)y帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一方面存在放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢挂环N二抗與一種一抗結(jié)合。另一方面，通常比用普通熒光染料標(biāo)記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
DNA染色
您可能想使用熒光染料研究核酸。例如，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞核來(lái)定義細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。最常見(jiàn)的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強(qiáng)度會(huì)增加。它被最大波長(zhǎng)為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對(duì)于 RNA 結(jié)合，也可以檢測(cè)到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質(zhì)膜，使其對(duì)固定細(xì)胞和活細(xì)胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項(xiàng)是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢(shì)的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結(jié)合條件下移動(dòng)到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)物中的活細(xì)胞和死細(xì)胞，因?yàn)樗荒苓M(jìn)入完整細(xì)胞。碘化丙啶 也是一種嵌入劑，但對(duì)不同的堿基沒(méi)有結(jié)合偏好。在核酸結(jié)合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為 538 nm。最高發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動(dòng)到較低的波長(zhǎng)和較低的強(qiáng)度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結(jié)合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無(wú)需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產(chǎn)生差異的染料是 吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對(duì)在 DNA 結(jié)合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進(jìn)入酸性區(qū)室，如陽(yáng)離子染料質(zhì)子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙 被藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強(qiáng)。它通常用于識(shí)別凋亡細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冇泻芏啾煌淌傻乃嵝愿糸g
