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怎么做交聯染色質免疫共沉淀（X-ChIP）實驗
Release Time：2020-07-20一、交聯染色質免疫共沉淀（X-ChIP）實驗簡介：
二、交聯染色質免疫共沉淀（X-ChIP）實驗所需材料及試劑：
三、交聯染色質免疫共沉淀（X-ChIP）實驗步驟
1.交聯和細胞收獲
甲醛可以使蛋白質與DNA交聯。交聯結果的質量取決于對交聯時間的把握，樣品的交聯時間通常為2-30分鐘，過度的交聯會降低抗原結合和超聲破碎效率。抗原決定簇也將被掩蓋，添加甘氨酸可以消除甲醛并終止交聯反應。
1.1準備兩個充滿細胞的150cm2細胞培養皿（1 * 107-5 * 107個細胞/皿），將甲醛直接滴入用PBS洗滌的細胞培養皿中，使最終濃度達到0.75％，然后在室溫下緩慢旋轉10分鐘以使蛋白質和DNA交聯。
1.2加入甘氨酸使終濃度達到125mM，并在室溫下振蕩孵育5分鐘。
1.3用10ml預冷的PBS洗滌細胞兩次。
1.4用刮板將收集的細胞放入5ml的預冷PBS中，并轉移到50ml的試管中。
1.5向培養皿中加入3ml PBS，將剩余細胞轉移至50ml管中，并以1000g離心5分鐘。
1.6倒出上清液，并用FA裂解緩沖液（1x107cells /750μl）重懸沉淀。
初始細胞應為1 * 107-5 * 107，并按上述終濃度0.75％甲醛和甘氨酸處理。用預冷的PBS洗滌3次，以1,000g離心5分鐘，然后用FA裂解緩沖液重懸沉淀。
2超聲波破壞
2.1超聲裂解細胞懸液可將DNA均勻地破碎成500-1000bp的片段，不同的細胞系需要不同的超聲時間才能獲得最佳結果，應通過時間梯度超聲選擇交聯細胞，以選擇最佳超聲條件，樣品經過時間梯度，分離DNA，檢測片段大小序列，并在1.5％瓊脂糖凝膠上進行分析。
2.2超聲波破壞后，8000g，30秒，4°C,離心。將上清移入新的管子中，開始準備進行染色質免疫共沉淀（IP）。
2.3每個超聲樣品取50ul，此時樣品標記為INPUT，用于定量DNA濃度和PCR空白對照。超聲后的染色質應立即在液氮中冷凍或在-70°C下保存2個月，避免反復凍融。
3.檢測DNA濃度
3.1INPUT樣品用于計算后續IP樣品的DNA濃度，DNA可以通過PCR純化試劑框（添加70ul洗脫液，然后輸入3.2a）或使用苯酚/氯仿萃?。ㄌ砑?50ul洗脫液，然后按照3.2b）2a。加入2ul RNaseA（0.5mg / ml），加熱至65°C，搖動4-5小時或過夜以反向交聯，使用PCR純化試劑盒中的制造商說明純化DNA，將樣品冷凍并儲存在-20℃，之所以將RNaseA添加到樣品中，是因為使用PCR純化試劑盒時高濃度的RNA會干擾DNA的純化，確定純化柱的飽和度。
3.2加入5ul蛋白酶K（20mg / ml），加熱至65°C并搖動4-5小時或過夜以反向交聯，用苯酚/氯仿提取的DNA用乙醇沉淀在10ul糖原（5mg / ml）中，重懸于100ul水中，將樣品冷凍并儲存在-20℃，用蛋白酶K處理樣品，以將相鄰的肽切割成具有羧基的芳族和脂族氨基酸，蛋白質和DNA之間的交聯被DNA純化打斷。
3.3檢測DNA濃度，將5ul純化的DNA放入995ulTE中，將原始溶液稀釋200倍，并測量其OD260，則DNA的濃度為OD260x10,000.μg/ ml，可以計算出染色質產物的DNA濃度。
4.免疫共沉淀
4.1對于從2.2獲得的染色質產品，建議每個IP樣品使用25ug DNA，為每個樣品添加RIPA溶液的比例為1:10，需要樣品作為空珠的對照。
4.2將一抗添加到每個樣品（空珠對照樣品除外）中，根據過去的經驗添加抗體的量，1-10ug抗體/ 25ugDNA效果更好。
4.3向所有樣品中添加20ul蛋白A / G珠子（之前已超聲處理成單鏈鯡魚精子DNA和BSA吸附，請參見步驟4.3a），在4°C搖動IP過夜，3a蛋白A / G珠和單鏈鯡魚精子DNA，如果同時使用蛋白A珠和蛋白G珠，則將兩個珠等量混合，并用RIPA溶液洗滌3次，除去RIPA溶液，添加單鏈鯡魚精子DNA至珠的最終濃度至75ng /μl，然后使用BSA將珠的最終濃度設定為0.1μg/μl，加入兩倍體積的珠子，并在室溫下孵育30分鐘，用RIPA洗滌一次，然后添加相同體積的RIPA。
4.4將蛋白A / G珠以2000g離心1分鐘，然后除去上清液。
4.5用1ml WashBuffer溶液，2,000g，離心1分鐘洗滌小珠3次，然后除去上清液，6用1ml FinalWashBuffer溶液，2,000g，離心1分鐘洗滌小珠一次，并除去上清液，如果觀察到背景很高可增加洗滌次數，另外，超聲處理后的染色質也可以在步驟4.2之前與蛋白A / G珠一起孵育1小時，可以通過此附加步驟除去任何非特異性吸附，將上清液（超聲染色質）倒入新管中，使用抗體和珠子。
5.洗脫和反向交聯
5.1使用120ul ElutionBuffer將蛋白A / G珠添加到蛋白A / G珠中，并在30°C搖動15分鐘以洗脫DNA。
5.2以2000g離心1分鐘，然后將上清液轉移至新試管中，此時樣品可在-20°C下冷凍3DNA可通過PCR純化試劑盒純化或苯酚/氯仿沉淀，4DNA量水平可通過定量PCR檢測，引物和探針通?？梢允褂枚縋CR機上的軟件進行設計，也可以使用在線設計軟件。
四、交聯染色質免疫共沉淀（X-ChIP）實驗所需的試劑清單：
| 序列 | 產品名 | 貨號 | CAS | 備注 |
| 1 | 乙醇 | CCF12679 |
127852-29-3 | |
| 2 | 甲醛 | CCF10222 | 349149-07-1 | |
| 3 | 甘氨酸 | SS3763 | 56-40-6 | |
| 4 | 90mm*20mm 塑料培養皿(滅菌） | FM-90-G | ||
| 5 | 10*10cm方形塑料培養皿(滅菌） | FM-100-F | ||
| 6 | PBS | HC1488 | ||
| 7 | 瓊脂糖 | SF0013 | 9012-36-6 | |
| 8 | 苯酚 | JT24025 | 108-95-2 | |
| 9 | 氯仿 | BDM000285 | 67-66-3 | |
| 10 | RNaseA | HC1334 | ||
| 11 | 蛋白酶K | SS2244 | 39450-01-6 | |
| 12 | RIPA裂解液 | HC1242 |
